将采用物理、化学或药物的手段将微生物全部杀死。大家都知道在食用菌栽培材料及空气、水和用具上到处都有微生物存在，当培养一种真菌时，培养基、器皿或用具必须经过灭菌后才能使用，否则会使培养物被其他真菌或微生物侵染而影响实际栽培。灭菌的方法很多，常用的方法有以下几种。
1、干热灭菌。由于一般玻璃用具，培养皿、吸管等将灭菌材料。用报纸包好后，放入烘箱中。使温度逐渐升至150—160℃保持2小时后，关闭电源。使缓慢冷却。（降温太快时玻璃易碎）即灭菌完毕。
2、湿热灭菌。湿热灭菌就是利用蒸汽杀菌。它不需要像干热灭菌时那样高的温度，因为加热杀菌是使微生物的蛋白质凝固。而蛋白质凝固时与含水量、温度等有关，含水量大时使其凝固所需要的温度低，反之、含水量小使其凝固时所需要的温度高，温热灭菌又分常压和高压两种。 ①、常压法 常压灭菌是用蒸汽锅（或普通锅）蒸的方法。温度达到100℃起一般需要4—6小时，温度不超过100℃时，根据灭菌量的多少，一般保持在8—24小时。即可达到无菌效果。在没在高压灭菌设备或在高温灭菌易破坏的培养基情况下多采用此法。另常压灭菌还有间歇灭菌法。 此法比较麻烦，通常必须进行三次。每次一小时，因为第一次蒸后，其中营养细胞被杀死，而其芽胞还保持着活力，所以蒸后，将培养基放入温箱中24小时，待其芽胞萌发后，再蒸第二样再经24小时，蒸第三次，这样才能灭菌彻底。 ②、高压法 此法乃是利用高压蒸汽杀菌锅进行灭菌，当用蒸汽灭菌时，如锅内增加压力，则温度亦随之增高，例如压力0.56公斤/厘米2=0.55帕斯卡。温度为112.6℃；如压力1公斤/厘米2=0.98帕斯卡。温度可达120—121℃。通常理想灭菌干120℃，20分钟能达到目地。115℃、30分钟也就可以了。使用高压杀菌锅时要分别注意两点。一是增压前必须把锅内冷空气排尽，否则压力虽然升高，而其温度达不到要求。二是灭菌完毕后，应使锅内压力徐徐下降，不然，容皿中液体会喷出。棉塞也易脱落，致使前功尽弃，在无烘箱时，其它器皿也可用温热灭菌，灭菌前应该用纸包好。
3、火焰灭菌。对于接种针或其它金属用具的灭菌，可直接在酒精灯火焰上烧至红热，此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采取通过火焰而达到灭菌的目地。
4、药物灭菌。所用药品种类其多，只例三种 ①70%酒精，用于冷却烧红后的接种针，操作前手或用具的表面杀菌，载玻片，盖玻片的浸泡等。②新洁尔灭、 市售一般为5%溶液，用时稀释至万分之一到千分之一，用于工作环境和器皿表面的灭菌。③0.1%升汞液：用于材料表面的杀菌，用具或废弃的培养物实验后的处理。④福尔马林（40%由醛溶液）：用于空间的熏蒸灭菌，加热或加高锰酸钾使放尽甲醛气体，注意将空间密闭并维持24小时
5、紫外线灭菌，用于接种室等的空气灭菌。
